欢迎访问上海飒凌电子科技有限公司网站!
主营产品:样品前处理仪器,低温冷链冰箱
产品系列
首页 > 新闻动态 >分子生物学实验技术—凝胶电泳、成像篇

分子生物学实验技术—凝胶电泳、成像篇

点击次数:56次  发布时间:2020-05-15

分子生物学实验技术—凝胶电泳、成像篇

上海飒凌电子 2020-5-15

 

琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有"分子筛""电泳"的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构,分子通过时会受到阻力,大分子物质受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小。

DNA 在碱性条件下(缓冲液pH8.0)带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正极移动,不同DNA   篇段由于分子和构型不同,在电场中的泳动速率也不同。核酸染料可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可分出不同的区带。


 

https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/ejO2hN8AIpuGjcB8DCrX2N3RZoUhu33XSEVOpBz8zLhKmBXNeCWZib4nZG3PARtSu5Zuhib30907v94VHr6mvWQQ/640?wx_fmt=png&tp=webp&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1

 

 

哪些因素会影响DNA分子的迁移速率呢?

DNA 的分子大小

 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。

琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kbDNA篇段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kbDNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%DNA篇段大小介于两者间所需胶浓度为0.8-1.0%

DNA分子构象

DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动很快,而开环双链DNA移动最慢。

 电源电压

在低电压时,线状DNA篇段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA篇段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kbDNA篇段有效分离所加电压不得超过5V/cm

嵌入染料的存在

染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低。

离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。

因此,在实际电泳过程中需要充分考虑以上几种因素,选择合适的电泳条件,从而达到理想的实验结果。

 

凝胶电泳过程中所用到的实验器具及试剂主要有:

水平电泳仪,恒温水浴锅/微波炉,移液器,缓冲液,琼脂糖,核酸染料,DNA Ladders


 

实验步骤:

1. 安装电泳槽,准备制胶

根据实验需求及目的,选择合适的制胶板及梳子。


 

2. 制备琼脂糖凝胶

根据DNA的篇段大小,选择琼脂糖溶解在电泳缓冲液中的比例。称取琼脂糖置于缓冲液中,选择水浴锅或者微波炉加热至完全溶解,并摇匀。


 

https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/ejO2hN8AIpuGjcB8DCrX2N3RZoUhu33Xm3cItPyrC9jDES2w5Ib9U3GFibXiadIpBpnOPUQS8k9ukiaOvwVmHWCWg/640?wx_fmt=png&tp=webp&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1

 

3. 灌胶

     将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。

 

4. 待琼脂糖凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,拔出梳子。

 

5. 加样

       将DNA样品与加样缓冲液按比例混匀后,用移液器加到样品槽中。


 

6. 电泳

     安装好电极导线,打开电源,调节电压3-5V/cm,当溴酚蓝到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。

 

7. 染色和观察

       取出凝胶,放进含有核酸染料的稀释液中(按说明书要求稀释,或者在制胶过程中加到凝胶内)染色,在紫外或者蓝光灯下观察。

 

 

在实验过程中需要注意一下内容:


 

(1)凝胶成像系统的选择:成像产品主要可以分为蓝光系统和紫外系统。

蓝光切胶仪的光源为蓝光,发射波长为470nm,对实验人员及样品的损害较小。适用于一些安全染料,如:SYBR SafeSYBR Green I 等。

紫外光源适用于所有染料,254nm、365nm312nm 三种不同的波长可选择。


 

(2)DNA Ladders 的选择:所扩增的片段应在DNA Ladders的指示范围内,否则无法起到指示作用。


 

 

联系人
  • 手机

    18955357450

在线客服